献给解题：常用的细胞凋亡检测方法

在实验者中都经常必须侦测肝细胚的增生情形，这里总结了几种常见的增生侦测律则，希望需要帮到你。

一肝细胚增生的哺乳类侦测

暴发增生的肝细胚在构造上有一定的构造。

光学镜片和倒置镜片

未切片肝细胚：增生肝细胚的锥表面积变小、变形，肝细胚上皮细胞比较简单但再次出新现PVC周期性，肝细胚增生更较早可见增生小锥体。贴壁肝细胚再次出新现皱缩、变圆、脱落。

切片肝细胚：惯用姬姆萨切片、瑞氏切片等。增生肝细胚的肝细胚精炼、被忽视，核分裂上皮细胞乙烯、肝细胚分割成大小不一和增生小锥体等类似的增生构造。

发光镜片和共借助于红均扫描镜片

一般以肝肝细胚肝细胚的哺乳类相反为高效率来硬照肝细胚增生的方面情形。

惯用的 DNA DNA表达衍生物有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种衍生物与 DNA 的相结合都亦非嵌入式的，主要相结合在 DNA 的 A-T 序列区。紫均光激发时升空夜空的白色发光。

Hoechst 是与 DNA 特异相结合的活性衍生物，储存试管用蒸馏水混和 1 mg/ml 的酸度，运用于时用 PBS 精炼，终因酸度为 10 μg/ml。

DAPI 为半特异性，常用正因如此一般而言肝细胚的切片。储存试管用蒸馏水混和 1 mg/ml 的酸度，运用于终因酸度一般为 10 μg/ml。

结果硬照

肝细胚增生反复中都肝肝细胚肝细胚的哺乳类相反分为三期：Ⅰ 期的肝肝细胚呈波纹形如（rippled）或呈折缝样（creased），部分肝细胚再次出新现精炼形如况；Ⅱa 期肝肝细胚的肝细胚整体凝聚、被忽视；Ⅱb 期的肝肝细胚乙烯为碎块，诱发增生小锥体（由此可知 1）。

透射电子镜片推论

结果硬照

增生肝细胚锥表面积变小，肝细胚质精炼。增生Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的肝肝细胚内肝细胚整体盘绕，再次出新现许多称为气穴周期性（citations）的空泡结构；Ⅱa 期肝肝细胚的肝细胚整体凝聚、被忽视；肝细胚增生的更较早，肝肝细胚乙烯为碎块，诱发增生小锥体（由此可知 2）。

二Annexin V 律

甘油酰选择性（Phosphatidylserine, PS）经常性位处肝细胚上皮细胞的下方，但在肝细胚增生的最初，PS 可从肝细胚上皮细胞的下方翻转到肝细胚上皮细胞的表面，暴露在肝细胚均环境中都（由此可知 3）。Annexin-V 是一种羧酸量为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性甘油相结合核糖体，能与 PS 很低亲和力DNA表达相结合。将 Annexin-V 进行发光素（FITC、PE）或 biotin 标有，以标有了的 Annexin-V 作为发光探针，利用流式肝细胚仪或发光镜片可侦测肝细胚增生的暴发。

锰丙啶（propidine iodide, PI）是一种核分裂酸衍生物，它不能透过比较简单的肝细胚上皮细胞，但在增生中都更较早的肝细胚和临死前肝细胚，PI 需要透过肝细胚上皮细胞而使肝肝细胚红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配运用于，就可以将增生较早更较早的肝细胚以及临死前肝细胚区别开来。

律则

悬浮肝细胚的切片：将经常性培植和游离增生的悬浮肝细胚（0.5～1×106）用 PBS 扫 2 次，转为 100 μl Binding Buffer 和 FITC 标有的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，加热避光 30 min，再转为 PI（50 μg/ml）5 μl，避光重排 5 min 后，转为 400 μl Binding Buffer，当即用 FACScan 进行流式肝细胚术定量侦测（一般不大约 1 h）， 同时以不纳 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为单数相异。

贴壁培植的肝细胚切片：再用 0.25% 的胰酶小肠，浇、切片和分析方法同悬浮肝细胚。

爬片肝细胚切片：同上，最后用发光镜片和共借助于红均扫描镜片进行推论。

结果

注意事项

1. 整个操作特技要尽量婉转，切勿用力吹打肝细胚。

2. 操作时注意避光，重排顺利完成后尽较早在一每隔内侦测。

三线粒锥体上皮细胞电势的侦测

线粒锥体在肝细胚增生的反复中都起着枢纽效用，多种肝细胚增生刺激q之均可游离相同的肝细胚暴发增生，而线粒锥体跨上皮细胞电位（Δψm）的下降，被认为是肝细胚增生激活重排反复中都最较早暴发的事件，它暴发在肝肝细胚增生构造（肝细胚精炼、DNA 碎裂）再次出新现之前，一旦线粒锥体跨上皮细胞电位崩溃，则肝细胚增生凋亡。

线粒锥体跨上皮细胞电位的共存，使一些亲脂性镁发光衍生物如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可相结合到线粒锥体基质，其发光的大幅提很低或减弱说明线粒锥体内上皮细胞电负性的增纳或减低。

律则

将经常性培植的肝细胚和游离增生的肝细胚转为运用于终因酸度为 Rhodamine 123（1 mM）或终因酸度为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 平衡 30 min，流式肝细胚计侦测肝细胚的发光风力。

注意事项

1. 始终因保持平衡染试泵都 pH 倍数的一致性，因为 pH 倍数的叠加将影响上皮细胞电位。

2. 与衍生物达致平衡的肝细胚悬试泵都如果另有有核糖体，他们将与部分衍生物相结合，减低衍生物的酸度，引起假去极化。

四DNA 段落化侦测

肝细胚增生时主要的生化构造是其肝细胚暴发精炼，肝细胚 DNA 在核分裂小锥体单位相互间的并排碎裂，诱发 50～300 kbp 较宽的 DNA 大段落，或 180～200 bp 整数倍的寡核分裂苷酸段落，在黏性小羧酸上显出新为梯形小羧酸由此可知谱（DNA ladder）。

肝细胚经妥善处理后，引入正因如此律则复合提纯 DNA，进行琼脂糖黏性小羧酸和溴化乙啶切片，在增生肝细胚群中都可推论到类似的 DNA ladder。如果肝细胚量非常少，还可在复合提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和嘧啶核分裂苷酸下侧转移酶（TdT）标有 DNA，然后进行小羧酸和放射自显像，推论增生肝细胚中都 DNA ladder 的诱发。

生物上皮细胞切片锥体 DNA 段落的测

肝细胚增生的最初，切片锥体碎裂带入 50～300 kbp 较宽的 DNA 大段落。所有大约一定羧酸量个数的双链 DNA 羧酸在琼脂糖黏性中都的移入速度相同。频域 DNA 的双螺旋运动速度大约黏性运动速度时，即达致分辨力的极限。此时黏性便按羧酸量的个数来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向带电粒子一极而通过黏性，这种移入方式在称之为「钻进」。因此，肝细胚增生最初诱发的 50～300 kbp 较宽的 DNA 大段落不能用普通的琼脂糖黏性小羧酸来复合。

多半引入激光小羧酸技术可体悟地补救这一问题。这个律则是在黏性上均纳正交的交变激光带电粒子。每当带电粒子路径相反后，大的 DNA 羧酸便滞留在钻进泵都，直至取而代之带电粒子横向重新定向后，才能继续向前移动。DNA 羧酸量越大，这种重排所必须的时间就越较宽。当 DNA 羧酸变换路径的时间小于电激光周期时，DNA 就可以按其羧酸量个数分开。

DNA Ladder 测

律则

赚得肝细胚（1×107）结晶→肝细胚乙烯试管→13 000 rpm ×5 min→搜集上清，纳 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，孵化 2 h→核糖体酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 锥表面积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍锥表面积的冷无水乙醇结晶 DNA，4 °C 住处→14 000 rpm×15 min→最后将结晶结晶在 TE buffer 中都，纳 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖黏性小羧酸，EB 切片并照相。

结果

增生肝细胚 DNA 另有量的流式肝细胚计分析方法

律则

搜集肝细胚→70% 冷乙醇（PBS 精炼）4 °C 一般而言住处→PBS 浇，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 小肠 30 min→PI（50 mg/ml）切片，加热避光 15 min→FACScan 分析方法 DNA 亚二倍锥体的诱发及肝细胚周期的叠加。

结果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

优点：精准度很低，简便侦测少量抽样，小部分增生肝细胚。如病理活民间组织侦测。

五TUNEL 律

肝细胚增生中都，切片锥体 DNA 双链碎裂或单链碎裂而诱发大量的粘性 3'-OH 下侧，可在嘧啶核分裂苷酸下侧转移酶（TdT）的效用下，将嘧啶核分裂苷酸和发光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素诱发的衍生物标有到 DNA 的 3'-下侧，从而可进行增生肝细胚的侦测，这类律则称为嘧啶核分裂苷酸下侧转移酶激活的缺口下侧标有律（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于经常性的或正在增殖的肝细胚几乎并未 DNA 的碎裂，因而并未 3'-OH 诱发，非常少需要被切片。TUNEL 实际上是羧酸生物学与哺乳类相相结合的学术研究律则，对比较简单的单个增生肝肝细胚或增生小锥体进行则会切片，能精准地重排肝细胚增生类似的物理化学和构造构造，可常用石蜡包埋民间组织切片、冰块民间组织切片、培植的肝细胚和从民间组织中都复合的肝细胚的肝细胚构造测，并可侦测出新极少量的增生肝细胚，因而在肝细胚增生的学术研究中都被普遍引入。

六Caspase-3 活性的侦测

Caspase 家族在激活肝细胚增生的反复中都起着非常举足轻重的效用，其中都 Caspase-3 为这两项的继续执行羧酸，它在增生信号均周的许多途径中都把握特性。Caspase-3 经常性以酶原（32 KD）的形式共存于粘液中都，在增生的最初阶段，它被激活，酪氨酸的 Caspase-3 由两个大核糖体（17 KD）和两个小核糖体（12 KD）组成，乙烯相应的粘液胚核分裂羧酸，最终因导致肝细胚增生。但在肝细胚增生的更较早和临死前亡肝细胚，Caspase-3 的活性明显下降。

Western blot

分析方法 Procaspase-3 的酪氨酸，以及酪氨酸的 Caspase-3 及对羧酸多聚（ADP-核分裂糖）序列（PARP）等的乙烯。

律则

搜集肝细胚→PBS 浇→抽提肝细胚乙烯试管→核糖体定量→SDS-PAGE 小羧酸→纤维素上皮细胞或 PVDF 上皮细胞转移→5% 脱脂封闭，加热 1.5～2 h 或 4 °C 住处→Caspase-3 多抗或单抗加热重排 1～2 h 或 4 °C 住处→TBS-T（另有 0.05% Tween 20 的 TBS）扫 3 次，5～10 min/次→HRP-标有的绵羊抗鼠 IgG 或 AP 标有的绵羊抗鼠 IgG 加热重排 1～2 h→ TBS-T 扫 3 次， 5～10 min/次→ECL 显像或 NBT/BCIP 显色。

结果

发光测光光度计分析方法

酪氨酸的 Caspase-3 需要特异切割 D1E2V3D4-X 羧酸，水解 D4-X 肽键。根据这一特点，均观设计出新发光物质催化的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共价催化时，AMC 不能被激发发光，短肽被水解后释放出新 AMC，公民权利的 AMC 才能被激发升空发光。根据释放的 AMC 发光风力的个数，可以测 Caspase-3 的活性，从而反映 Caspase-3 被酪氨酸的程度。

律则

赚得肝细胚经常性或增生肝细胚→PBS 浇→制备肝细胚乙烯试管→纳 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 发光羧酸）→37 °C 重排 1 h→发光测光光度计（Polarstar）分析方法发光风力（激发光波较宽 380 nm，升空光波较宽为 430～460 nm）。

结果

流式肝细胚术分析方法

律则

赚得肝细胚经常性或增生肝细胚→PBS 浇→纳 Ac-DEVD-AMC→37 °C 重排 1 h→UV 流式肝细胚计分析方法 Caspase-3 阳性肝细胚数和最低发光风力。

结果

七TFAR19 核糖体暗示和肝细胚适配分析方法

TFAR19（PDCD5）是由本学术研究室在在世界上首再引述的一个拥有自己财产权的人类新DNA，前期的特性学术研究表明，它是促进肝细胚增生的大幅提很低剂。利用发光素（FITC）标有的 TFAR19 单克隆抗锥体为探针，对肝细胚增生反复中都 TFAR19 核糖体的暗示精准度及适配学术研究发现，增生最初 TFAR19 暗示精准度增纳并再次出新现快速核分裂复合周期性，伴随着肝肝细胚哺乳类的叠加，持续较较宽时间，在增生小锥体中都基本上可见。

同时我们发现，增生最初 TFAR19 核糖体的核分裂复合较早于甘油酰选择性（PS）均露和肝肝细胚 DNA 的段落化，提示 TFAR19 核糖体的核分裂复合是肝细胚增生更最初暴发的事件之一。再进一步的学术研究证明，增生最初 TFAR19 的核分裂复合具有普遍意义，相同肝细胚增生最初之均再次出新现 TFAR19 很低暗示和核分裂复合。这为学术研究肝细胚增生最初所暴发的事件，给予了一种取而代之技术和高效率。

TFAR19 核糖体的肝细胚适配分析方法

材质阴离子

FITC 标有的单克隆抗锥体，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 另有 0.2% Tween 20），胎牛胰岛素，发光肝细胚扫试管（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 另有 2% 胎牛胰岛素及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移试管器。

电子设备

加热精准度离心机，37 °C 水浴装有，发光镜片，共借助于红均扫描镜片，流式肝细胚仪。

律则

1. 悬浮肝细胚的切片

（1）赚得经常性和游离增生的肝细胚（0.5～1×106），PBS 扫 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 扫 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）转为 PBS-T 溶试管，37 °C 孵化 15 min，PBS 扫 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）转为 200 ml 胎牛胰岛素，加热重排 30 min。

（5）转为 5 ml FITC 标有的 TFAR19 单抗（终因酸度为 1:40），4 °C 重排 30 min。

（6）发光肝细胚扫试管扫 2 次，1 000 rpm×10 min。

将肝细胚结晶滴片，发光镜片及共借助于红均镜片下推论 TFAR19 在肝细胚中都的适配。同时用流式肝细胚仪定量侦测 TFAR19 核糖体的最低发光风力。

2. 贴壁肝细胚的则会切片

（1）贴壁生较宽的对数期肝细胚铺在 24 盖或 6 盖板中都（下有洁净盖玻片），让其爬片生较宽，待较宽到 50%～80 % 满时，增生游离剂妥善处理肝细胚。

（2）将相同时间点妥善处理的肝细胚进行免疫发光切片，切片步骤同上。

（3）将切片的爬片肝细胚放于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，发光镜片或共借助于红均扫描镜片推论 TFAR19 在肝细胚中都的适配。

3. 病理病理切片的切片、侦测

4. 原代肝细胚的培植、侦测

5. 分析方法 TFAR19 核糖体在人锥体内各民间组织器官的分布及适配

TFAR19 核糖体的暗示与病理病因

ELISA 律侦测经常性人和病因形如况下，以及病因的相同时期，胰岛素中都 TFAR19 核糖体精准度及其 TFAR19 自身抗锥体精准度。

材质和阴离子

1. 大块 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer

2. 浇试管： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 另有 0.05% Tween 20

3. 封闭试管： 3% BSA（用浇试管配制）

4. 酶标抗锥体的精炼：用封闭试管精炼

5. OPD 羧酸 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，乙醇 0.51 g，DDW 100 ml

6. 显色试管（现配现用）：羧酸 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 重新启动试管 2 mol/L H2SO4

8. 重组人 TFAR19，HRP 标有的绵羊抗人 IgG9 ELISA 板，Tip，移试管器，ELISA Reader（OD 490 nm），扫板机

操作步骤

1. 用大块 Buffer 精炼的重组人 TFAR19（1 mg/ml）大块 ELISA 板，100 ml/well，37 °C 孵化 2 h 或 4 °C 住处（一般 24 h 以上）。

2. 浇 Buffer 扫板三次，转为封闭试管，200 ml/well ， 37 °C 孵化 2 h 或 4 °C 住处。

3. 浇 Buffer 扫板三次，转为相同精炼度的产妇胰岛素（3 个重复盖）100 ml/well ，37 °C 孵化 1 h。设大块 Buffer、浇 Buffer 、封闭试管为单数相异。

4. 浇 Buffer 扫板三次，转为 1:2 500 精炼的 HRP 标有的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 孵化 1 h。

5. 浇 Buffer 扫板三次，转为显色试管，100 ml/well，避光重排 10～15 min。

6. 转为 H2SO4 重新启动重排，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度倍数，分析方法和比较产妇胰岛素和经常性鲜血 清中都 TFAR19 自身抗锥体的暗示精准度。

8. Western blot 分析方法原发性肝细胚和经常性肝细胚的 TFAR 19 核糖体的暗示精准度。

注释

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

文章举例：丁香园站友 midas

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