最新研究成果 RDS，可肾脏抑制新冠、非典及甲型流感病毒感染

A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro

Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*

▋摘要

或多或少：目前为止恰巧蹂躏亚太北部的新型冠状大肠杆菌患病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和北部大风行，截至 2021 年 4 年底已导致多达 1.28 亿人接种，多达 280 数百人丧命。理论上，尚无可必需增大 COVID-19 致患病的用药新方法。我们数据库分析了一种习惯的之中医口服制剂——惟有肺毒口服液 (RDS) 的潜在外用冠状大肠杆菌活命功能性，该口服液主要组分为和西方病理学习惯之中常用用药肺部功能性疾患病的之药用树种。

结果：RDS 减缓 SARS-CoV 极快大肠杆菌、SARS-CoV-2 极快大肠杆菌、结合风行功能性感冒大肠杆菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型大肠杆菌以及传染功能性 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 变型大肠杆菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶酶的接种。我们全面不可否认 RDS 可以反之亦然灭活命 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质的传染功能性。此外，我们却说到 RDS 还可阻绝风行功能性感冒风行功能性感冒大肠杆菌对靶酶的接种。

推论：RDS 可相当多减缓肠胃大肠杆菌接种。ID：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状大肠杆菌，外用大肠杆菌用药，惟有肺毒口服液，习惯之中医，SARS-CoV，风行功能性感冒风行功能性感冒，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型大肠杆菌

▋或多或少

目前为止恰巧蹂躏亚太北部的新型冠状大肠杆菌患病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和北部大风行，截至 2021 年 4 年底已导致多达 1.28 亿人接种，多达 280 数百人丧命。理论上，尚无可必需增大 COVID-19 致患病的用药新方法。新经常出现的 COVID-19 大肠杆菌寄生虫为冠状大肠杆菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在轻微急功能性呼抽综合征就其冠状大肠杆菌种类之中的姊妹大肠杆菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在之西方却说到的；SARS-CoV 大肠杆菌于 2002 年 11 年底在广东省首次被却说到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年底在郑州首次被却说到[1,7,8]。在之西方，这两次由冠状大肠杆菌造成的疫情之中，之中医均被相当多用到，用以及时解决情况冠状大肠杆菌造成的功能性疾患病。对于理论上的 COVID-19 大风行，之西方有多达 85% 的 SARS-CoV-2 接种患病患者接受了习惯之首倡临床（9，10）。许多用到的之中医是否区别于必需的外用冠状大肠杆菌特功能性并在诊断上是否必需，这个最重要情况尚未得不到充分答复。

之中医作为用药冠状大肠杆菌所随之而来功能性疾患病的必需临床，但由于缺少人体内或肾脏的的系统数据库分析，其发展与合理用到均受到了顾虑。为了明确之中医的潜在外用 SARS-CoV-2 活命功能性，我们从常用之中医之中挑选了多种蜂蜜杀菌剂，并从之中医口服液 RDS(澳大利亚一种商业化功能性食品摄入) 之中却说到了外用 SARS-CoV 和外用 SARS-CoV-2 大肠杆菌的活命功能性，一种在澳大利亚的商业化食品摄入。RDS 常用增强体液消化道的总体肥胖症，其涵盖多种蜂蜜组分，如灵芝和景天，它们是习惯上常用高度集中增生和肺部功能性疾患病的之药用树种 (11-13)。在此，我们新闻报道 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假大肠杆菌以及区别于接种功能性的野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌对靶酶的接种区别于介导。我们全面证明 RDS 可通过反之亦然灭活命大肠杆菌基质或阻扰大肠杆菌侵入而减缓大肠杆菌的以前接种短时间表。此外，我们却说到 RDS 还可以阻扰甲流大肠杆菌对靶酶的接种。这些得出，RDS 对肠胃大肠杆菌的接种不太可能区别于相当多的介导。

▋结果

为了从习惯之药用树种之中却说到潜在的外用 SARS-CoV-2 活命功能性，我们从约四十种习惯蜂蜜之中挑选提取出 SARS-CoV-2S 酶假型极快大肠杆菌[14,15] 和体液肺部 A549(ACE2) 靶酶，此生物 ACE2 基因不太会通过极快大肠杆菌转导作为核盐酸介导，从而稳定转导来发挥作用激解读。极快假型大肠杆菌用到绿色白光酶 (GFP) 或白光亦同酶 (Luc) 作为新闻报道基因，并通过了区别于广谱外用大肠杆菌进入减缓剂，以及拉伊索勒 (Arbidol)[16]，和生物外用毒血清对外用 SARS-CoV-2(布 1a、C) 的验证。我们必须成功精确测量到拉伊索勒 (Arbidol) 和外用毒血清对于 SARS-CoV-2 假型大肠杆菌的介导，这是我们在其他四十余种习惯蜂蜜杀菌剂验证之中不不太会却说到的，还包括其之中一些依赖于较高毒亦同的蜂蜜 (布 1a-C)。然而，鉴于极快功能性假型大肠杆菌大部分能精确测量 SARS-CoV-2 大肠杆菌的侵入行为，我们不会排除这些蜂蜜杀菌剂不太可能有在进入后阶段必须减缓 SARS-CoV-2 的不太可能功能性。我们全面从习惯类固醇惟有肺毒口服液 (RDS) 之中挑选出了不太可能的外用 SARS-CoV-2 活命功能性，该新产品富含九种蜂蜜组分——、奎宁、灵芝、景天、龙胆、苦杏仁、蜂房、皂角、胭脂，在之西方习惯上常用用药肺部功能性疾患病 (11-13)。

富含甲基果汁盐酸、3，4-二邻果汁酰基奎宁盐酸、甲基 3，4-二邻果汁酰基奎宁盐酸、原儿茶盐酸、甲基绿原盐酸和木犀草亦同；小叶之中还富含酰 A、B 和 10 种已知环烯醚天冬氨盐酸酰[17]；该树种还富含皂甙甙 A 和 B，以及外用增生作用的酰 C[18,19]。奎宁酯酰之中富含木脂亦同、松脂醇和奎宁酰[20]。灵芝之中富含被称为灵芝皂酰的甾体皂酰，是灵芝旧称树种有别于的树种糖类[21,22]。细叶景天之中主要活命功能性组分为四种单天冬氨盐酸，(−)-草莓苯、(+)-里斯博利厄苯、(−)-柠檬烯和 (+)-草莓芳基；这种树种还富含其他化合物，如 1-辛烯-3-醇、3-辛苯、β-年底桂烯和β-冬青烯[23]。龙胆富含多达 162 种化合物，还包括环烯醚天冬氨盐酸和环烯醚天冬氨盐酸酰、苯丙酰、乙盐酸、天冬氨盐酸类、糖类、黄苯类、和皂酰[24]。苦杏仁之中富含酚类、氰基化合物和果胶脂质[25]。皂角刺之中富含皂酰和羽扇豆盐酸[26,27]，而胭脂之中富含主要活命功能性组分胭脂盐酸[28]。为了全面验证 RDS 的外用 SARS-CoV-2 活命功能性，用不同酒精溶解度的 RDS 模板 A549(ACE2) 酶，然后让这些酶在依赖于 RDS 的但不太会接受 4-6 每隔的接种。接种后，在不依赖于 RDS 的但不太会人才酶，然后在 48 和 72 每隔的时候，通过流的的设计酶心法对大肠杆菌接种的介导顺利进行二阶。为了高度集中酶毒亦同，用到碲丙啶 (PI) 对即将丧命和已丧命的酶顺利进行染料，大部分在活命酶群之中归纳 GFP+酶。如布 2 示意图，我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假大肠杆菌区别于副作用相反功能性介导。为了猜测这些结果，我们用到人体内解读 ACE2 的 VeroE6 酶重复了该接种科学数据库分析。

(却说下页布)

ACE2 之外解读，装配功能性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 大肠杆菌可对其顺利进行接种，ACE2 通常常用冠状大肠杆菌的数据库分析 (7)。考虑在缺少 ACE2 激解读 [15，29，30] 的但不太会，假型大肠杆菌对 VeroE6 的接种功能性较少，我们还用到了白光亦同酶新闻报道基因假型大肠杆菌，该大肠杆菌的新闻报道基因解读由 HIV-1LTR 和 Tat 涡轮机，区别于很低的新闻报道基因敏感功能性和增益。

布 2：RDS 减缓 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌接种 A549(ACE2) 酶。

A.A549(ACE2) 酶用 RDS 紧接著酒精 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌接种。将酶干净去大肠杆菌和 RDS，并在不依赖于 RDS 的但不太会顺利进行人才。流的的设计酶明为精确测量大肠杆菌接种减缓情况。未接种的酶和接种 SARS-CoV-2(GFP) 但未经 RDS 用药的酶作为比对。GFP+酶平均值已推断。(PI) 碲丙啶。

B.RDS 的酶毒亦同分析方法。A549(ACE2) 酶用 RDS 紧接著酒精 4 每隔，干净去 RDS，无 RDS 人才 48 每隔。碲丙啶染料鉴定悄悄丧命酶和已丧命酶，流的的设计酶心法归纳。画副作用-催化酶毒亦同圆弧，RDS 的半伤人溶解度 (LC50) 分之一为 1:11.9。

如布 3A 示意图，我们用到 Luc 研究报告基因假大肠杆菌和 VeroE6 酶顺利进行接种科学数据库分析，通过观察到 RDS 对该大肠杆菌接种区别于副作用相反功能性介导，并且分之二减缓溶解度明确为 1:230RDS 酒精度 (布 3B)。我们还二阶了 RDS 对 VeroE6 酶活命力的直接影响，明确了 50% 酶丧命副作用为 1:11.8RDS 酒精度。

布 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假大肠杆菌和野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌的副作用相反功能性减缓介导。用 RDS 紧接著酒精模板 A、BVeroE6 酶，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型大肠杆菌接种。将酶干净去大肠杆菌和 RDS，并在不依赖于 RDS 的但不太会顺利进行人才。在接种后 72 每隔用白光亦同酶精确测量大肠杆菌接种的介导。未接种酶和 SARS-CoV-2-luc 接种但未经过 RDS 用药的酶作为比对。科学数据库分析重复三次。画副作用催化圆弧和 RDS 的 I-C50 酒精分之一为 1:230。CRDS 对 VeroE6 酶的酶毒亦同也通过碲丙啶染料和流的的设计酶心法分析方法。用 RDS 紧接著酒精 4 每隔，干净去 RDS，在不含 RDS 的但不太会人才 72 每隔。画酶毒亦同副作用-催化圆弧，RDS 的半伤人溶解度 (LC50) 分之一为 1:13.8 酒精。DRDS 减缓传染功能性 SARS-CoV-2 接种。用紧接著酒精的 RDS 模板 VeroE6 酶，并在 RDS 依赖于的但不太会接种 SARS-CoV-2。接种 48 每隔后，通过暴菌斑归纳大肠杆菌释放后的大肠杆菌克隆减缓情况。减缓试验功能性一的的设计三份顺利进行，并在 Prism7(Graph Pad) 之中用到单向自变量 (One-Way ANOVA) 归纳及 Dunnett 后验 (Dunnett's Post Test)，依此明确统计显着功能性。测量误差值用星号指出如下：*p

为了全面验证用到假大肠杆菌授予的结果，我们验证了 RDS 对于 SARS-CoV-2 接种的阻绝传染功能性意志力。如布 3D 示意图，RDS 同时也阻绝了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 酶的接种。RDS 在酒精 1:40 以上时可显著减少大肠杆菌黄褐色的成型。

综上，通过 SARS-CoV-2 假大肠杆菌与传染功能性大肠杆菌的得出，RDS 富含减缓 SARS-CoV-2 接种的活命功能性组分，不太可能是通过反之亦然灭活命大肠杆菌或阻绝大肠杆菌的以前接种短时间表。

为全面数据库分析不太可能的的的系统，我们将传染功能性 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质与紧接著酒精的 RDS 在 37°C 下预人才 1 每隔。随后，将甲醇全面左至右酒精-(10–1 至 10–4)，并自组 Vero 酶顺利进行暴菌斑归纳以明确大肠杆菌接种功能性的增大。如布 4A 示意图，我们通过观察到在 RDS 之中短暂暴露一每隔后的大肠杆菌基质，其 SARS-CoV-2 的接种效价也红褐色副作用相反功能性下降。该结果猜测了 RDS 可必需反之亦然灭活命 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质的传染功能性。

我们全面验证了 RDS 是否也能减缓 SARS-CoV-2 大肠杆菌变型的接种。为此，我们能用值得注意开发的设计的结合甲大肠杆菌-SARS-CoV-2 假型大肠杆菌 (Ha-CoV-2)[31] 来提纯一新作 S 酶例外，还包括英国例外 (B.1.1.7)，南非例外 (B.1.351)，乌拉圭例外 (P.1)，赞州例外 (B.1.429)，和其他几个新兴例外 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和就其 S 酶基因突变体在 37°C 紧接著酒精 RDS 人才 1 每隔。随后，用该甲醇接种 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶酶。接种后 12 每隔，白光亦同酶精确测量大肠杆菌接种的介导。如布 4B 示意图，我们还通过观察到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 酶例外的副作用相反功能性减缓。

我们还验证了 RDS 阻绝 SARS-CoV 接种的意志力，用到区别于 SARS-CoV 突刺酶的 GFP 新闻报道基因极快大肠杆菌和[15] 伪副作用。我们将人 A549(ACE2) 酶用作靶酶，将其用新作酒精的 RDS 模板，然后用 SARS-CoV(GFP) 研究报告基因假大肠杆菌接种 4-6 每隔。接种后在不含 RDS 的但不太会人才酶，流的的设计酶心法二阶精确测量其对大肠杆菌接种的介导。同样，用到碲丙啶排除悄悄丧命与已丧命的酶，大部分在活命酶群之中归纳 GFP+酶。如布 5A 示意图，我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型大肠杆菌的介导红褐色副作用相反功能性。我们全面猜测了这些结果，并二阶了 RDS 介导的减缓与 Luc 新闻报道基因 SARS-CoV 假型大肠杆菌，SARSCoV(Luc)。我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的介导红褐色副作用功能性相反，其半减缓溶解度 (IC50) 为 1:70.88 酒精度 (布 5B，C)。考虑 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用到 ACE2 接种靶酶，我们还验证了 RDS 的外用大肠杆菌活命功能性是否大部分针对与 ACE2 有粒子的冠状大肠杆菌。为此，我们精确测量了一种不就其的负链 RNA 大肠杆菌；还有风行功能性感冒风行功能性感冒大肠杆菌。它通过大肠杆菌血凝亦同 (HA) 和酶α-唾液盐酸来接种靶酶。为了提纯风行功能性感冒风行功能性感冒大肠杆菌，将解读风行功能性感冒风行功能性感冒 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个核盐酸和一个 GFP-新闻报道基因共计转染到 HEK293T 酶之中。在 RDS 依赖于的但不太会，得来大肠杆菌基质并常用接种最大限度 MDCK 酶。如布 6A 示意图，我们通过观察到 RDS 对风行功能性感冒风行功能性感冒大肠杆菌的介导红褐色副作用相反功能性。RDS 在 1:40 和 1:80 酒精时可显然阻绝大肠杆菌接种，在 1:160 酒精时则可部分减缓风行功能性感冒风行功能性感冒。RDS 对 MDCK 酶的半伤人溶解度 (LC50) 经精确测量为 1:18.5(布 6B)。这些得出，RDS 的外用大肠杆菌活命功能性并非针对特定大肠杆菌，而不太可能必须相当多减缓多种肠胃大肠杆菌，如冠状大肠杆菌和风行功能性感冒风行功能性感冒大肠杆菌。

▋咨询

在本研究报告之中，我们不可否认习惯类固醇惟有肺毒口服液 (RDS) 富含广谱外用大肠杆菌活命功能性，可阻绝 SARS-CoV、SARSCoV-2 和风行功能性感冒风行功能性感冒大肠杆菌的接种。虽然 RDS 必须减缓多种大肠杆菌，但其外用大肠杆菌活命功能性因大肠杆菌类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 极快假大肠杆菌的 I-C50 溶解度为 1:7.9 酒精度，对 SARS-CoV-2 极快假大肠杆菌的 I-C50 溶解度为 1:230 酒精度。对于传染功能性野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌，I-C50 为 1:40 酒精度，对风行功能性感冒风行功能性感冒，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变型有不同的介导，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 酒精度不等 (布 4B)。

(却说下一页布)

布 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 变型区别于副作用相反功能性灭活命作用。ASARS-CoV-2 基质赞紧接著酒精的 RDS 在 37°C 下人才 1 每隔。随后，将甲醇全面紧接著酒精，并自组 Vero 酶之中顺利进行暴菌斑归纳，以明确大肠杆菌接种功能性增大。减缓试验功能性一的的设计三份顺利进行，并在 Prism7(GraphPad) 之中用到单向自变量 (One-WayANOVA) 归纳和 Dunnett 后验 (Dunnett'sPostTest) 依此明确统计显着功能性。测量误差值用星号指出如下：*p

BHa-CoV-2(Luc) 和就其 S 酶例外与紧接著酒精的 RDS 在 37°C 人才 1 每隔后，用甲醇接种 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶酶。接种后 12 每隔，白光亦同酶精确测量大肠杆菌接种的介导。RDS 的 IC50 值的酒精度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。

我们全面不可否认 RDS 可以减缓冠状大肠杆菌的以前接种短时间表。虽然具体的外用大肠杆菌的的系统尚未正确，但 RDS 可以通过反之亦然灭活命大肠杆菌基质或通过阻扰大肠杆菌侵入或阻绝大肠杆菌侵入后的以前短时间表来阻扰大肠杆菌接种。在其他几种习惯之中医之中也却说到了外用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活命功能性。例如，一种常却说的习惯之中医——胭脂。

胭脂根之中已证明富含胭脂盐酸亦同，可减缓 SARS 大肠杆菌[32] 诊断分离株的克隆。此外，另一种可常用用药肠胃功能性疾患病的之中医——双黄连制剂，已推断出在肾脏以副作用相反功能性方的的设计减缓 SARS-CoV-23CL 酶酶 (3CLpro) 活命功能性。石杉酰和石杉亦同拟作为双黄连阻绝 3CLpro[33] 的必需组分。

布 5 RDS 减缓 SARS-CoV 假型大肠杆菌对 A549(ACE2) 酶的接种。用紧接著酒精的 RDS 模板 A、B 酶，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型大肠杆菌接种。将酶清干净，改成大肠杆菌和 RDS，在不依赖于 RDS 的但不太会顺利进行人才。在接种后 48 每隔和 72 每隔，通过流的的设计酶心法或白光亦同酶精确测量来分析方法大肠杆菌接种的介导。科学数据库分析重复三次。画副作用组织起来圆弧，并画 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 酒精度 (C)

布 6 RDS 减缓甲流大肠杆菌对 MDCK 酶的接种。(A) 用紧接著酒精的 RDS 模板 MDCK 酶 30 分钟，然后用甲流大肠杆菌 (GFP) 对其顺利进行接种。接种后，在 RDS 依赖于下人才酶。36 每隔后用流的的设计酶明为对大肠杆菌接种的介导顺利进行分析方法。把未接种的酶与被甲流大肠杆菌 (GFP) 接种但未经 RDS 执行的酶顺利进行对比。布之中推断了 GFP+酶的平均值。PI 指出碲丙啶 PI。

(B) 另外还用到了 MTT 精确测量法分析方法了 RDS 对 MDCK 酶的毒亦同，画了酶毒亦同的副作用-催化圆弧，经计算，RDS 的分之二伤人溶解度为 1:18.5 酒精度 RDS 的必需外用大肠杆菌组分尚未明确。然而，RDS 不同于石杉酰和石杉亦同，RDS 可以通过反之亦然灭活命大肠杆菌相对论功能性来阻绝大肠杆菌接种 (布 4)，而石杉酰和石杉亦同则在大肠杆菌可持续的后期通过阻绝大肠杆菌酶酶的活命功能性来发挥作用。然而，RDS 的肾脏外用 SARS-CoV-2 活命功能性仍需在今后的昆虫数据库分析和生物诊断试验功能性之中得不到猜测。目前为止，我们悄悄顺利进行小型昆虫科学数据库分析，以明确 RDS 在人体内阻绝 SARS-CoV-2 大肠杆菌接种的潜力。

▋推论

我们的数据库分析确实，RDS 可相当多减缓肠胃大肠杆菌的接种，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和风行功能性感冒风行功能性感冒。

▋新方法

酶和酶人才

HEK293T (ATCC 博拉迪，新泽西州) MDCK (ATCC 博拉迪，新泽西州)，VeroE6 (ATCC 博拉迪，新泽西州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 还给，博拉迪，新泽西州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 还给，博拉迪，新泽西州) 目前为止保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔信息技心法 Thermo Fisher Scientific) 富含 10% 热灭活命 FBS 和 1×衍生物-芽孢 (赛默飞世尔信息技心法 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 酶人才基之中分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的溶解度自组嘌呤霉亦同和潮霉亦同 B。

原核生物转染和大肠杆菌提纯

含 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的极快功能性假型大肠杆菌基质由 Virongy LLC (Manassas，VA) 发放，或按照上面详细描述的新方法[15] 提纯。简言之，为了提纯 GFP 新闻报道基因极快功能性假大肠杆菌，HEK293T 酶与解读 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的核盐酸、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共计转染。为了产出白光亦同酶新闻报道基因极快功能性假型大肠杆菌，将 HEK293T 酶与解读 SARSCoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的核盐酸、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 顺利进行共计转染。转染后 48 每隔得来大肠杆菌上清液，离心浓缩，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 发放。pHW-NAGFP (ΔAT6) 研究报告基因原核生物和 A/WSN/1933 H1N1 衍生原核生物 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 教授友好发放。在风行功能性感冒大肠杆菌 A-GFP 新闻报道基因相对论功能性提纯之中，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共计转染 HEK293T 酶 (ΔAT6)。48 每隔后得来大肠杆菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 解读核盐酸购自 Sinobiological。能用 Twist Bioscience 衍动物了 Ha-CoV-2(Luc) 核盐酸和 S 酶基因突变核盐酸。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶基因突变相对论功能性按照上面详细描述新方法[31] 顺利进行提纯。

大肠杆菌接种和类固醇减缓试验功能性

RDS(惟有肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 还给，利斯堡，新泽西州) 是由白马教授科学数据库分析室 (Burnaby，BC，Canada) 装配的一种商业化新产品。RDS 之中所有之药用树种组分均符合《之西方食品卫生 2015 年版》「饮片」基准，还包括必需组分含量及重金旧称、农药限量精确测量。RDS 是一种之中医的共计煎剂，先次催化催化在液态必须下蒸发。SARS-CoV-2 外用血清由 LanceA. Liotta 医生发放。将拉伊朵尔盐盐酸盐 (Sigma) 重新碎屑在二甲基亚砜 (Sigma) 之中。对于假型大肠杆菌接种，12 孔板之中的 A549(ACE2) 酶 (来自 Virongy LLC 还给，博拉迪，新泽西州) 或 VeroE6 酶用 RDS 模板 30 分钟，在 37℃ 下接种 4-6 每隔，然后在水果人才基之中干净涤人才 48-72 每隔。对于 VeroE6 酶的接种，酶也被 CoV-2 假型大肠杆菌接种增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 还给，博拉迪，新泽西州) 模板后，在 37°C 下先执行 30 分钟。用到 GloMaxDiscover 酶标明为 (Promega) 归纳酶裂解物的白光亦同酶活命功能性。对于野生型 SARS-CoV-2 接种，VeroE6 酶在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 接种 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在爱德华沃恩的学校的 BSL-3 收容设施内停留 1 每隔。酶用 PBS 干净涤 2 次，用含 RDS 的人才基人才 48 每隔。从上清之中提取大肠杆菌，用 12 孔板人才的 Vero 酶单层之中的暴菌斑试验功能性精确测量小瓶滴度。简言之，每个样本在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 人才基 (VWR) 之中提纯，涵盖 1X 衍生物-芽孢 (VWR)，并添赞 10% 的 FBS(赛默飞世尔信息技心法 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种酒精液抽附到 VeroE6 酶单层的三个平行孔上 1 每隔。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分完整的 Eagle Minimal Essential 人才基 (VWR) 的甲醇其余部分单层，含 1X 衍生物-芽孢，并添赞 10%FBS。48 每隔后，将单层膜浮动在 10% 甲醛溶液之中 1 每隔，并添加其余部分的琼脂库姆。为了染料黄褐色，自组富含 20% 乙醇的 1% 结晶紫染料溶液 5 分钟，然后用去离子水干净涤。对于风行功能性感冒风行功能性感冒大肠杆菌接种 MDCK 酶，在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 A-GFP 新闻报道基因大肠杆菌接种 6 每隔。用含 RDS 的人才基干净涤酶，人才 36 每隔。GFP 解读通过流的的设计酶明为分析方法。(FACSCalibur，BD Biosciences).

对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质的 RDS 灭活命试验功能性，将 100μl 紧接著酒精的 RDS 添赞到 1 mlSARS-CoV-2 大肠杆菌原液 (3.65×105PFU/ml) 之中，先次 RDS 酒精为 1:20，1:40 或 1:80。也还包括比对必须 (1 ml 大肠杆菌+100μl 人才基)。甲醇在 37°C 下人才 1 每隔。随后，对甲醇顺利进行新作酒精以导致额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 酒精度，并将紧接著酒精的样本自组 12 孔板之中的 Vero 酶之中，常用顺利进行暴菌斑精确测量归纳。黄褐色精确测量之中先次的 RDS 酒精度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 酒精液。

Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶基因突变相对论功能性按照上面详细描述的新方法[31] 提纯。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活命，将 5μl 紧接著酒精的 RDS 添赞到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或例外之中，先次 RDS 酒精度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将甲醇在 37°C 下人才 1 每隔，然后在 RDS 依赖于下接种 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 酶 12 每隔。用到 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 归纳酶裂解物的白光亦同酶活命功能性。

酶毒亦同归纳精确测量

用碲丙啶染料和流的的设计酶心法二阶对 A549 (ACE2) 酶和 VeroE6 酶的类固醇酶毒亦同顺利进行精确测量，如说明了 (34)。用到酶增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和供应商敦促的方案对 MDCK 酶的类固醇毒亦同顺利进行二阶。简言之，将 MDCK 酶 (ATCC) 以每孔 1×-105 个酶的平均速度接种到 12 孔板之中。酶人才隔夜后，通过 RDS 执行 1 天，然后在 MTT 标记试剂 (Sigma) 的人才基之中人才。将酶与标记试剂共计同人才 4 每隔，先后续自组 MTT 增溶液。人才皿孵卵住处，用 GloMax Discover 酶标明为 (Promega) 精确测量抽光度。

缩写

SARS-CoV：轻微急功能性消化道综合症就其冠状大肠杆菌；SARSCoV-2：Severe 轻微急功能性消化道综合症就其冠状大肠杆菌-2；TCM：习惯之中医；RDS：肠胃排毒口服液；Ha-CoV-2：结合风行功能性感冒新冠大肠杆菌假大肠杆菌。

来向

深受感动 FengLi 发放风行功能性感冒大肠杆菌解读核盐酸，深受感动 LanceLiotta 发放外用毒血清；深受感动 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的咨询与敦促；深受感动 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 发放 RDS 和蜂蜜杀菌剂。

作者建树

此次科学数据库分析由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 的设计，由 Y.W. 写稿，由 L.A.H. 总编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该科学数据库分析。所有作者已阅读并批文先次稿件。

资金投入

本数据库分析的经费来自于爱德华沃恩的学校之外拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该捐款由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 发放。

数据库和碳化的可用功能性

本数据库分析之中导致或归纳的所有数据库均涵盖在本文之中。试剂可从 Y.W 处获取。

通告

批文及作准备达成协议

不适用

达成协议出版社

不适用

竞争对手利益

爱德华沃恩的学校国家动物防御和传染患病之该中心的 RMH 和 YW 已授予了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的数据库分析大力支持，LAH 为德佳和畅担任助理并授予了报酬。不不太会其他关系或社区活命动不太可能不太会直接影响到提请的实习。

作者详细信息

1澳大利亚新泽西州爱德华沃恩的学校的系统动物学大学国家动物防御和传染患病之该中心，博拉迪 20110。

2VirongyLLC，新泽西州博拉迪。3赞拿大人伯纳比，BCV5J0E5 白马教授科学数据库分析室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 澳大利亚新泽西州利斯堡联合国大不太会科学组织，20176。

收稿日期：2021 年 4 年底 7 日

接受日期：2021 年 5 年底 10 日

线上出版社短时间：2021 年 5 年底 29 日

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